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 WB實(shí)驗(yàn)流程
 

●樣本采集保存，蛋白提取相關(guān)知識，請

●蛋白定量和蛋白變性相關(guān)知識，請

現(xiàn)在正式進(jìn)入跑膠環(huán)節(jié)，這一次，讓小編帶您總結(jié)一下制膠相關(guān)的知識點(diǎn)：

SDS-凝膠電泳系統(tǒng)采用的是不連續(xù)性系統(tǒng)，上層為濃縮膠（或積層膠），下層為分離膠，先配制分離膠，濃縮膠pH 6.8，可以通過甘氨酸和和氯離子之間形成的電壓對蛋白樣品產(chǎn)生壓縮，從而使蛋白樣品壓成一條狹窄的條帶，處于同一條線上；分離膠pH 8.8，與甘氨酸的pka接近，從而使不同分子量的蛋白產(chǎn)生不同的泳動速度，從而使不同分子量的蛋白分開。

分離膠濃度參考：

（1）分離膠配制

確定凝膠濃度后，用5mL移液器按照配方依次加入所需試劑于配膠燒杯中，若配置凝膠體積較少（少于15mL），加完所需試劑后，需要吹打膠溶液10次混勻。注：吹打過程中，速度不能過快，每組吸液放液時間在3s左右；每次放液不要全部放完，防止產(chǎn)生氣泡。

（2）灌膠

凝膠溶液混勻后，將槍頭置于凹玻璃板中間位置讓膠溶液沿平玻璃板壁緩緩注入凹玻璃板與平玻璃板之間的膠室，注意控制速度，防止產(chǎn)生氣泡。如有氣泡產(chǎn)生，用200μL移液器將氣泡吸出。

（3）壓膠（液封）

灌膠完成后立即吸取1ml無水乙醇或純水，沿平玻璃板壁緩緩注入凹玻璃板與平玻璃板之間的膠室。

（4）凝膠

在室溫凝膠，時間30min。凝膠過程中，不可晃動膠板，否則會造成分離膠液面不平。

（5）除壓膠液

確定膠凝固之后將無水乙醇倒入廢液缸（然后用吸水紙將制膠器表面殘留的無水乙醇擦拭干凈。再用一小截濾紙伸入兩塊板的膠室，吸去多余的無水乙醇，直至看不見有明顯的殘留，禁止濾紙觸碰到膠表面。

（6）濃縮膠配制

按照配方加入所需試劑于配膠燒杯中，吹打混勻。吹打過程中，速度不能過快，防止氣泡產(chǎn)生。

（7）灌膠

凝膠溶液混勻后，立即移液器吸取凝膠溶液，將槍頭置于凹玻璃板中間位置，將膠溶液沿著平玻璃板壁緩緩注入凹玻璃板與平玻璃板之間的膠室，注意防止產(chǎn)生氣泡。如有氣泡產(chǎn)生，用200μL移液器將氣泡吸出。

（8）插樣品梳

灌膠后立即將樣品梳緩慢的插入兩塊玻璃板當(dāng)中，采用梳子一端從玻璃板的一邊角落斜向下插入，然后向前、向下推進(jìn)的方式插入凝膠中，使梳齒*插入凝膠中，插入的樣品梳應(yīng)與平玻璃板保持水平狀態(tài)，不可傾斜。

（9）凝膠

凝膠時間為20min。20分鐘后，確定濃縮膠已凝固，用雙手的食指與拇指捏住梳子，平行往上拔出梳子，查看濃縮膠的梳齒是否整齊，將歪斜的膠齒用注射器針頭撥齊。

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