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無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)
本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。 離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。 Solarbio公司研制的內(nèi)毒素清除劑，可大限度地除去內(nèi)毒素。從50-100ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取200-300μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)85-90%。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染等要求較高的實(shí)驗(yàn)，以及其他各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。
使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液P1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
操作步驟:
1、取50-100ml細(xì)菌培養(yǎng)物，11000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。
2、向留有菌體沉淀的離心管中加入4ml溶液P1(請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器*懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
3、向離心管中加入4ml溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要超過(guò)5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。
4、向離心管中加入4ml溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。11000rpm
離心10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5、加入上清1/5體積的冰上預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑，振蕩混勻，溶液變渾濁，冰浴2min溶液變清亮。
6、37℃水浴5min,不時(shí)振蕩，溶液又變渾濁。11000rpm室溫離心5min，溶液應(yīng)分為兩相，上層水相含質(zhì)粒DNA，下層油相含內(nèi)毒素。
7、將含質(zhì)粒DNA的上層水相轉(zhuǎn)移新管，棄下層油相，注意不要吸入油狀相。重復(fù)抽提三次，即重復(fù)步驟5-7三次。
8、加入12ml的結(jié)合液，充分混勻后加入吸附柱中，室溫放置2min，11000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。如果溶液量多可分多次加入。
9、向吸附柱中加入8ml漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，11000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
10、向吸附柱中加入6ml漂洗液，11000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
11、11000rpm離心3min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。
12、將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加1-2ml經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，11000rpm離心2min。
13、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5min，11000rpm離心2min。
注意事項(xiàng):
1. 使用前請(qǐng)先檢查溶液P2、P3和結(jié)合液是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。
2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于1ml，體積過(guò)小影響回收效率;洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍)， pH值低于7. 0會(huì)降低洗脫效率， DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。
3. 質(zhì)粒DNA濃度＞1mg/ml時(shí)清除內(nèi)毒素效率降低。由于質(zhì)粒DNA本身的性質(zhì)，清除過(guò)程可導(dǎo)致部分質(zhì)粒DNA丟失，但內(nèi)毒素卻能得到大限度清除。
4. 所有溶液應(yīng)用無(wú)內(nèi)毒素的高純水配制，所有器械材料均應(yīng)不含內(nèi)毒素，玻璃器皿可高溫烘烤，非揮發(fā)性水溶液可高壓處理。
5. DNA濃度及純度檢測(cè)：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。 得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。 DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA、 40μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響吸光值，但并不表示純度低。
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